Ό,τι κι αν κάνετε, είτε οδηγείτε αυτοκίνητο, πηγαίνετε για τζόκινγκ, ή ακόμα και στα πιο νωχελικά σας, όταν τρώτε πατατάκια και παρακολουθείτε τηλεόραση στον καναπέ, υπάρχει μια ολόκληρη σειρά μοριακών μηχανών μέσα σε κάθε ένα από τα κύτταρά σας που εργάζονται σκληρά. Αυτές οι μηχανές πολύ μικρές για να τις δει κάποιος με γυμνό μάτι ή ακόμα και με πολλά μικροσκόπια, δημιουργούν ενέργεια για το κύτταρο, κατασκευάζουν τις πρωτεΐνες του, κάνουν αντίγραφα του DNA του και πολλά άλλα.
Μεταξύ αυτών των μηχανών, και ένα από τα πιο περίπλοκα, είναι κάτι που είναι γνωστό ως σύμπλεγμα πυρηνικών πόρων (NPC). Το NPC, το οποίο αποτελείται από περισσότερες από 1.000 μεμονωμένες πρωτεΐνες, είναι ένας απίστευτα διακριτικός φύλακας για τον πυρήνα του κυττάρου, τη συνδεδεμένη με τη μεμβράνη περιοχή μέσα σε ένα κύτταρο που κρατά το γενετικό υλικό αυτού του κυττάρου. Οτιδήποτε μπαίνει ή βγαίνει από τον πυρήνα πρέπει να περάσει μέσα από το NPC στο δρόμο του.
Ο ρόλος του NPC ως φύλακας του πυρήνα σημαίνει ότι είναι ζωτικής σημασίας για τις λειτουργίες του κυττάρου. Μέσα στον πυρήνα, το DNA, ο μόνιμος γενετικός κώδικας του κυττάρου, αντιγράφεται στο RNA. Αυτό το RNA μεταφέρεται στη συνέχεια από τον πυρήνα, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή των πρωτεϊνών που χρειάζεται το κύτταρο. Το NPC διασφαλίζει ότι ο πυρήνας λαμβάνει τα υλικά που χρειάζεται για τη σύνθεση RNA, ενώ προστατεύει επίσης το DNA από το σκληρό περιβάλλον έξω από τον πυρήνα και επιτρέπει στο RNA να εγκαταλείψει τον πυρήνα μετά την κατασκευή του.
«Είναι λίγο σαν υπόστεγο αεροπλάνων όπου μπορείς να επισκευάσεις 747 και η πόρτα ανοίγει για να μπει το 747, αλλά υπάρχει ένα άτομο που στέκεται εκεί και μπορεί να το εμποδίσει να βγει έξω όσο οι πόρτες είναι ανοιχτές», λέει ο André του Caltech. Hoelz, καθηγητής Χημείας και Βιοχημείας και Υπότροφος Σχολής του Ιατρικού Ινστιτούτου Howard Hughes. Για περισσότερες από δύο δεκαετίες, η Hoelz μελετά και αποκρυπτογραφεί τη δομή του NPC σε σχέση με τη λειτουργία του. Με το πέρασμα των χρόνων, αποκαλύπτει σταθερά τα μυστικά του, ξετυλίγοντάς τα κομμάτι-κομμάτι.
Οι επιπτώσεις αυτής της έρευνας είναι δυνητικά τεράστιες. Όχι μόνο το NPC είναι κεντρικό στις λειτουργίες του κυττάρου, αλλά εμπλέκεται επίσης σε πολλές ασθένειες. Οι μεταλλάξεις στο NPC είναι υπεύθυνες για ορισμένους ανίατους καρκίνους, για νευροεκφυλιστικές και αυτοάνοσες ασθένειες όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (ALS) και η οξεία νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια και για καρδιακές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της κολπικής μαρμαρυγής και του πρώιμου αιφνίδιου καρδιακού θανάτου. Επιπλέον, πολλοί ιοί, συμπεριλαμβανομένου αυτού που ευθύνεται για το COVID-19, στοχεύουν και διακόπτουν τη λειτουργία του NPC κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής τους.
Τώρα, σε ένα σύνολο δημοσιεύσεων στο περιοδικό Science , ο Hoelz και η ερευνητική του ομάδα περιγράφουν δύο σημαντικές ανακαλύψεις: τον προσδιορισμό της δομής της εξωτερικής όψης του NPC και την αποσαφήνιση του μηχανισμού με τον οποίο ειδικές πρωτεΐνες δρουν σαν μοριακή κόλλα. για να συγκρατήσει το NPC μαζί.
Ένα πολύ μικροσκοπικό τρισδιάστατο παζλ
Στην εργασία τους με τίτλο «Αρχιτεκτονική της κυτταροπλασματικής όψης του πυρηνικού πόρου», ο Hoelz και η ερευνητική του ομάδα περιγράφουν πώς χαρτογράφησαν τη δομή της πλευράς του NPC που βλέπει προς τα έξω από τον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Για να γίνει αυτό, έπρεπε να λύσουν το ισοδύναμο ενός πολύ μικροσκοπικού τρισδιάστατου παζλ , χρησιμοποιώντας τεχνικές απεικόνισης όπως ηλεκτρονική μικροσκοπία και κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε κάθε κομμάτι του παζλ.
Ο Στέφαν Πέτροβιτς, μεταπτυχιακός φοιτητής στη βιοχημεία και τη μοριακή βιοφυσική και ένας από τους πρώτους συγγραφείς των εργασιών, λέει ότι η διαδικασία ξεκίνησε με βακτήρια Escherichia coli (ένα στέλεχος βακτηρίων που χρησιμοποιείται συνήθως στα εργαστήρια) που κατασκευάστηκαν γενετικά για να παράγουν τις πρωτεΐνες που αποτελούν το ανθρώπινο NPC.
«Αν μπεις στο εργαστήριο, μπορείς να δεις αυτόν τον γιγάντιο τοίχο από φιάλες στον οποίο αναπτύσσονται καλλιέργειες», λέει ο Petrovic. «Εκφράζουμε κάθε μεμονωμένη πρωτεΐνη σε κύτταρα E. coli, σπάμε αυτά τα κύτταρα ανοιχτά και καθαρίζουμε χημικά κάθε συστατικό πρωτεΐνης».
Μόλις αυτός ο καθαρισμός – ο οποίος μπορεί να απαιτήσει έως και 1.500 λίτρα βακτηριακής καλλιέργειας για να ληφθεί αρκετό υλικό για ένα μόνο πείραμα – ολοκληρώθηκε, η ερευνητική ομάδα άρχισε να δοκιμάζει επίπονα πώς τα κομμάτια του NPC ταιριάζουν μεταξύ τους.
Ο Τζορτζ Μομπς, ανώτερος μεταδιδακτορικός επιστημονικός συνεργάτης στη χημεία και ένας άλλος συν-πρώτος συγγραφέας της εργασίας, λέει ότι η συνέλευση έγινε με «σταδιακό» τρόπο. Αντί να χύνουν όλες τις πρωτεΐνες μαζί σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα την ίδια στιγμή, οι ερευνητές δοκίμασαν ζεύγη πρωτεϊνών για να δουν ποιες θα ταιριάζουν μεταξύ τους, σαν δύο κομμάτια παζλ. Εάν βρισκόταν ένα ζευγάρι που ταιριάζει μεταξύ τους, οι ερευνητές στη συνέχεια θα δοκίμαζαν τις δύο πλέον συνδυασμένες πρωτεΐνες έναντι μιας τρίτης πρωτεΐνης μέχρι να βρουν μία που ταιριάζει με αυτό το ζεύγος, και στη συνέχεια η προκύπτουσα δομή τριών τεμαχίων δοκιμάστηκε έναντι άλλων πρωτεϊνών, και έτσι επί. Δουλεύοντας με αυτόν τον τρόπο τις πρωτεΐνες τελικά παρήγαγε το τελικό αποτέλεσμα του χαρτιού τους: μια σφήνα 16 πρωτεϊνών που επαναλαμβάνεται οκτώ φορές, σαν φέτες πίτσας, για να σχηματίσει την όψη του NPC.
“Αναφέραμε την πρώτη πλήρη δομή ολόκληρης της κυτταροπλασματικής όψης του ανθρώπινου NPC, μαζί με αυστηρή επικύρωση, αντί να αναφέρουμε μια σειρά από σταδιακές προόδους θραυσμάτων ή τμημάτων που βασίζονται σε μερική, ελλιπή ή χαμηλής ανάλυσης παρατήρηση”, λέει ο Si Nie, μεταδιδακτορικός επιστημονικός συνεργάτης στη χημεία και επίσης συν-συγγραφέας της εργασίας. «Αποφασίσαμε να περιμένουμε υπομονετικά μέχρι να αποκτήσουμε όλα τα απαραίτητα δεδομένα, αναφέροντας έναν τεράστιο όγκο νέων πληροφοριών».
Η εργασία τους συμπλήρωσε την έρευνα που διεξήχθη από τον Martin Beck του Ινστιτούτου Βιοφυσικής Max Planck στη Φρανκφούρτη της Γερμανίας, η ομάδα του οποίου χρησιμοποίησε κρυοηλεκτρονική τομογραφία για να δημιουργήσει έναν χάρτη που παρείχε τα περιγράμματα ενός παζλ στο οποίο οι ερευνητές έπρεπε να τοποθετήσουν τα κομμάτια. Για να επιταχύνουν την ολοκλήρωση του παζλ της ανθρώπινης δομής NPC, ο Hoelz και ο Beck αντάλλαξαν δεδομένα πριν από περισσότερα από δύο χρόνια και στη συνέχεια κατασκεύασαν ανεξάρτητα δομές ολόκληρου του NPC. “Ο ουσιαστικά βελτιωμένος χάρτης Beck έδειξε πολύ πιο καθαρά πού έπρεπε να τοποθετηθεί κάθε κομμάτι του NPC – για το οποίο προσδιορίσαμε τις ατομικές δομές – σαν ένα ξύλινο πλαίσιο που ορίζει την άκρη ενός παζλ”, λέει ο Hoelz.
Οι πειραματικά προσδιορισμένες δομές των κομματιών NPC από την ομάδα Hoelz χρησίμευσαν για την επικύρωση της μοντελοποίησης από την ομάδα Beck. “Τοποθετήσαμε τις δομές στον χάρτη ανεξάρτητα, χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις, αλλά τα τελικά αποτελέσματα συμφωνούσαν πλήρως. Ήταν πολύ ικανοποιητικό να το δούμε”, λέει ο Πέτροβιτς.
«Χτίσαμε ένα πλαίσιο πάνω στο οποίο μπορούν πλέον να γίνουν πολλά πειράματα», λέει ο Christopher Bley, ανώτερος μεταδιδακτορικός επιστημονικός συνεργάτης στη χημεία και επίσης πρώτος συγγραφέας. “Έχουμε αυτήν τη σύνθετη δομή τώρα, και επιτρέπει και ενημερώνει μελλοντικά πειράματα σχετικά με τη λειτουργία NPC, ή ακόμα και ασθένειες. Υπάρχουν πολλές μεταλλάξεις στο NPC που σχετίζονται με τρομερές ασθένειες και γνωρίζοντας πού βρίσκονται στη δομή και πώς να έρθουν μαζί μπορούν να βοηθήσουν στο σχεδιασμό της επόμενης σειράς πειραμάτων για να προσπαθήσουμε να απαντήσουμε στις ερωτήσεις σχετικά με το τι κάνουν αυτές οι μεταλλάξεις».
«Αυτή η κομψή σύνθεση με ζυμαρικά με μακαρόνια»
Στο άλλο έγγραφο, με τίτλο “Αρχιτεκτονική του συνδετικού ικριώματος στον πυρηνικό πόρο”, η ερευνητική ομάδα περιγράφει πώς προσδιόρισε ολόκληρη τη δομή αυτού που είναι γνωστό ως συνδετικό ικρίωμα του NPC – τη συλλογή πρωτεϊνών που βοηθούν στη συγκράτηση του NPC μαζί ενώ του παρέχει επίσης την ευελιξία που χρειάζεται για να ανοίγει και να κλείνει και να προσαρμόζεται ώστε να ταιριάζει στα μόρια που περνούν.
Ο Hoelz παρομοιάζει το NPC με κάτι κατασκευασμένο από τουβλάκια Lego που ταιριάζουν μεταξύ τους χωρίς να κλειδώνουν μεταξύ τους και αντ’ αυτού δένονται μεταξύ τους με λάστιχα που τα κρατούν ως επί το πλείστον στη θέση τους ενώ τους επιτρέπουν να κινούνται λίγο.
«Ονομάζω αυτά τα αδόμητα κομμάτια κόλλας «σκοτεινή ύλη του πόρου»», λέει ο Hoelz. «Αυτή η κομψή σύνθεση από ζυμαρικά με μακαρόνια συγκρατεί τα πάντα».
Η διαδικασία για τον χαρακτηρισμό της δομής του συνδετικού ικριώματος ήταν περίπου η ίδια με τη διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε για τον χαρακτηρισμό των άλλων τμημάτων του NPC. Η ομάδα κατασκεύασε και καθάρισε μεγάλες ποσότητες από τους πολλούς τύπους πρωτεϊνών συνδετήρων και ικριωμάτων, χρησιμοποίησε μια ποικιλία βιοχημικών πειραμάτων και τεχνικών απεικόνισης για να εξετάσει μεμονωμένες αλληλεπιδράσεις και τις δοκίμασε κομμάτι προς κομμάτι για να δει πώς ταιριάζουν μεταξύ τους στο άθικτο NPC.
Για να ελέγξουν τη δουλειά τους, εισήγαγαν μεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν καθεμία από αυτές τις συνδετικές πρωτεΐνες σε ένα ζωντανό κύτταρο. Εφόσον γνώριζαν πώς αυτές οι μεταλλάξεις θα άλλαζαν τις χημικές ιδιότητες και το σχήμα μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης συνδέτη, καθιστώντας την ελαττωματική, μπορούσαν να προβλέψουν τι θα συνέβαινε στη δομή των NPC του κυττάρου όταν εισαχθούν αυτές οι ελαττωματικές πρωτεΐνες. Εάν τα NPC του κυττάρου ήταν λειτουργικά και δομικά ελαττωματικά με τον τρόπο που περίμεναν, ήξεραν ότι είχαν τη σωστή διάταξη των πρωτεϊνών συνδέτη.
“Ένα κύτταρο είναι πολύ πιο περίπλοκο από το απλό σύστημα που δημιουργούμε σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα, επομένως είναι απαραίτητο να επαληθευτεί ότι τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από πειράματα in vitro ισχύουν in vivo”, λέει ο Petrovic.
Η συναρμολόγηση της εξωτερικής όψης του NPC βοήθησε επίσης να λυθεί ένα μακροχρόνιο μυστήριο σχετικά με το πυρηνικό περίβλημα, το σύστημα διπλής μεμβράνης που περιβάλλει τον πυρήνα. Όπως η μεμβράνη του κυττάρου μέσα στο οποίο βρίσκεται ο πυρήνας, η πυρηνική μεμβράνη δεν είναι απόλυτα λεία. Αντίθετα, είναι γεμάτο με μόρια που ονομάζονται πρωτεΐνες ενσωματωμένης μεμβράνης (IMPs) που χρησιμεύουν σε διάφορους ρόλους, συμπεριλαμβανομένου του να ενεργούν ως υποδοχείς και να βοηθούν στην κατάλυση βιοχημικών αντιδράσεων.
Αν και τα IMP μπορούν να βρεθούν τόσο στην εσωτερική όσο και στην εξωτερική πλευρά του πυρηνικού περιβλήματος, δεν ήταν σαφές πώς πραγματικά ταξίδευαν από τη μια πλευρά στην άλλη. Πράγματι, επειδή τα IMP είναι κολλημένα μέσα στη μεμβράνη, δεν μπορούν απλώς να γλιστρήσουν μέσω του κεντρικού καναλιού μεταφοράς του NPC όπως κάνουν τα ελεύθερα αιωρούμενα μόρια.
Μόλις η ομάδα του Hoelz κατανόησε τη δομή του συνδετικού ικριώματος του NPC, συνειδητοποίησε ότι επιτρέπει τον σχηματισμό μικρών «αυλακιών» γύρω από το εξωτερικό του άκρο που επιτρέπουν στα IMP να γλιστρήσουν πέρα από το NPC από τη μια πλευρά του πυρηνικού περιβλήματος στην άλλη ενώ μένοντας πάντα ενσωματωμένο στην ίδια τη μεμβράνη.
“Εξηγεί πολλά πράγματα που ήταν αινιγματικά στο πεδίο. Είμαι πολύ χαρούμενος που βλέπω ότι το κεντρικό κανάλι μεταφορών έχει πράγματι την ικανότητα να διαστέλλεται και να σχηματίζει πλευρικές πύλες για αυτά τα IMP, όπως είχαμε αρχικά προτείνει πριν από περισσότερο από μια δεκαετία », λέει ο Hoelz.
Συνολικά, τα ευρήματα των δύο εγγράφων αντιπροσωπεύουν ένα άλμα προς τα εμπρός στην κατανόηση των επιστημόνων για το πώς κατασκευάζεται το ανθρώπινο NPC και πώς λειτουργεί. Οι ανακαλύψεις της ομάδας ανοίγουν την πόρτα για πολύ περισσότερη έρευνα. «Έχοντας καθορίσει τη δομή του, μπορούμε τώρα να επικεντρωθούμε στην επεξεργασία των μοριακών βάσεων για τις λειτουργίες του NPC, όπως το πώς εξάγεται το mRNA και οι υποκείμενες αιτίες για τις πολλές ασθένειες που σχετίζονται με το NPC με στόχο την ανάπτυξη νέων θεραπειών», λέει ο Hoelz.
Οι εργασίες που περιγράφουν την εργασία εμφανίζονται στο τεύχος της 10ης Ιουνίου του περιοδικού Science .
